Биопринтинг – технологический раздел биофабрикации (см. определение)
- Это биомедицинское применение быстрого прототипирования (rapid prototyping) или послойной трехмерной печати (новой парадигмы всеобщей технологической революции) с целью решения проблемы получения копий живых органов для последующей пересадки пациенту.
- Это роботизированная (управляемая компьютером) технология или цифровая трехмерная печать. По определению Миронова, «Биопечать есть автоматический, управляемый компьютером процесс послойной депозиции/включения живых и биологически уместных/релевантных материалов с целью быстрого производства функционально состоятельных органов человека»
- Подготовленный на компьютере графический дизайн органа (blueprint) в стандартном формате обмена данными 3D-графики является обязательным атрибутом биопринтинга.
- Это технология, на современном этапе развития исключающая использование твердых скаффолдов для обеспечения тканевой целостности. Созданные («напечатанные») трехмерные тканевые биоконструкты должны формировать тканевую фиброзную основу самостоятельно без дополнительного полимерного скелета/матрикса.
- Это технология биопроизводства, основанная на принципах синтетической анатомии: от частного к общему через воссоздание органной структуры согласно известным законам физиологии и биологии развития.
- Фундаментальные биологические принципы, лежащие в основе биопринтинга, позволяющие рассчитывать на получение копий органов таким способом, базируются на явлении тканевого слияния (взаимного сплавления) отдельных тканевых блоков. Близко расположенные тканевые сфероиды (эмбриональные тела) имеют тенденцию сливаться (спаиваться) в единую массу. Этот процесс управляется (запускается) силами поверхностного натяжения и белкового межклеточного взаимодействия. Это есть повсеместно распространенное физическое явление в процессе живого развития организмов: таким путем формируются у эмбриона аорта, нервная трубка, мягкое небо носоглотки, верхняя губа и т.д.
- Основа развития биопечати как дисциплины – мультидисциплинарность, то есть, сочетание практических и теоретических знаний из разных областей науки: инженерного дела, механики, общей биологии, биологии развития, эмбриологии, биохимии, прикладной биотехнологии и информатики. Без объединения разносторонних специалистов и обмена информацией на взаимно понятном им языке невозможно развитие биопечати как технологического направления.
- Концепт быстрого/ускоренного вызревания тканей — этот другой краеугольный камень концептуальной базы технологии Organ Printing, — с физической точки зрения является явлением фазового перехода: индуцированного перехода от жидкой/подвижной фазы к твердому состоянию.
- Organ printing использует внутреннюю способность человеческих тканей к самоорганизации/самосборке. Это направленная самоорганизация. Такие фундаментальные биологические принципы технологии Organ Printing, как тканевое слияние, проявлены в биологической самоорганизации/самосборке.
Термин «самосборка» был дан George Whitesides из Harvard University в следующем определении: «Самосборка является автономной организацией неких компонентов в прототипы и структуры без вмешательства человека извне»
Биопечать помещает сфероиды близко рядом друг с другом (задание направления), а им остается только сливаться (осуществлять самосборку)
По мнению Миронова В.А. будущее клеточных технологий за использованием аутологичных клеткок взрослого человека. Во-первых, лучший банк для хранения клеток пациента – это он сам. Во-вторых, технологии репрограммирования позволяют исправлять те недостатки генома, которые возникли за время жизни пациента. В-третьих, аутологичные клетки не имеют искусственно привнесенного риска новообразований по сравнению с эмбриональными клетками.
Используемые термины и определения.
Тканевый сфероид. Упругий сгусток из живых клеток (от 1000 до 10 000 единиц) размером 200-300 мкм, который используется в работах Форгача, Миронова, Вэня и других исследователей в качестве основного материала для биофабрикации. По сути, это кирпичик тканевого здания, которое создается в искусственных условиях. Тканевые сфероиды в простом варианте получаются путем содержания/инкубации суспензии клеток (стволовых, фибробластов, гепатоцитов, миоцитов и др.) в небольшом объеме культуральной среды DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium). Для простого масштабирования используют инкубацию суспензии в плоских сосудах, содержащих в себе полимерные биоинертные формы в виде пчелиных сот, круглых или тороидальных колодцев. Более сложные технологии масштабирования при получении тканевых сфероидов в больших количествах основаны методах микрофлюидики или вибрационной генерации капель.
ADSC. Стволовые клетки адипозной (жировой) ткани. По большинству своих свойств эквивалентны стволовым клеткам костного мозга (marrow stem cells, MSC). В силу возможности одномоментного получения большого количества этих клеток от пациента мини-инвазивно с помощью липоаспирации, ADSC представляют собой наилучший с точки зрения доступности клеточный материал для биопечати.
Липоаспирация. Хирургический минимально-инвазивный метод получения адипозной ткани пациента в косметологии, с биопсийными или исследовательскими целями. В качестве инструмента для липоаспирации наиболее часто используется ультразвуковой липосактор.
Биофабрикация:
1. производство живых биотканей и органов искусственно, с помощью разработанных в лаборатории технологий.
2. название одноименного журнала.
Синтетическая анатомия. В отличие от классической анатомии, описательной по сути и анализирующей органы и структуры от совокупного к частному, синтетическая анатомия занята построением концепции работы органов от частного к совокупному на основе разработанного плана по достижению требуемой функции получаемого конструкта
Scaffold. Обозначает резорбируемый (деградируемый) тканевой или полимерный скелет/матрикс, который:
1. Служит пространственной и субстратной основой для возникновения новой ткани в биофабрикации. Характерным примером скаффолда может служить применяемый активно в регенеративной нейрохирургии коллагеновый матрикс Duragen производства Integra.
2. Служит объемной основой для напыления/нанесения дифференцированных или стволовых клеток при моделировании кожи, хряща, кости.
Для достижения цели реконструкции тканей скаффолды должны соответствовать некоторым специфическим требованиям. Высокая порозность и адекватный размер пор являются необходимым условием для обеспечения клеточного заселения и диффузии сквозь толщу имплантата как клеток, так и нутриентов (питательных жидкостей).
Graft — обобщенное обозначение трансплантата, независимо от природы его происхождения, наполнения или назначения. Может быть synthetic (искусственный), xenogenic (из тканей животных, главным образом свиной или говяжий), allogenic и autogenic.
Lockyball – в данном контексте это клеточный сфероид, заключенный в полимерную оболочку, получаемую с помощью стереолитографии. Оболочка выполнена в виде ажурной сферической конструкции с отростками на манер шипов репейника. Такие шипы служат скрепляющим механическим средством при составлении тканевых конструктов для мгновенного обеспечения более высокой механической прочности, которая не достижима с помощью существующих гидрогелей, требующих для полимеризации некоторого времени и цитотоксичных фотоактиваторов.
Биореактор. Аппарат для выращивания/культивирования или поддержания в жизнеспособном состоянии клеточных и тканевых структур/совокупностей.
Биопринтер. Аппаратный комплекс, диспенсер для послойного нанесения биочернил согласно 3D-плану, разработанному на компьютере.
Биочернила – суспензия тканевых сфероидов в гидрогеле, полученных в результате «самосборки» из суспензии одиночных клеток
Биобумага – в контексте биопринтинга, гидрогелевая подложка слоя тканевых сфероидов, выступающая в роли мягкого матрикса/скаффолда и скрепляющего сфероиды агента.
TGFbeta1 Transforming growth factor beta 1, фактор клеточной/тканевой дифференциации. Используется для ускорения вызревания тканевых образцов
PLGA, PLLA, PLA — полимеры молочной кислоты, материал для изготовления скаффолдов. Используются в основном в виде нанофибриллярных (нано-нитевых, неплетеных) пленок/мембран или в водном растворе в составе гелей.
Клеточная пропагация — процесс получения большого количества однородного вида клеточного материала.
Форсунка Фишмана. Шнековая (шнек — винтовой толкатель) форсунка, используемая в трехмерных ink-jet принтерах Форгача, Вэня, Миронова, применяемых в экспериментальной работе с клеточным материалом. Позволяет получать точное и управляемое/регулируемое выделение жидкого материала (биочернил) через капилляр в нано-литровых количествах, что выгодно отличает форсунку Фишмана от форсунки Нордсона. Винтовой толкатель (шнек) приводится в действие шаговым двигателем, управляемым в свою очередь микропроцессором.
Форсунка Нордсона. В результате получения патента на принцип пневмораспылителя/пульверизатора, компания Nordson в мире ассоциируется именно с последним, а имя компании стало нарицательным относительно всех устройств, где используется пневмораспыление воздушной струей. Применительно к биопринтингу форсунка Нордсона не имеет вид обычного воздушного пневмораспылителя, поскольку для дозирования материала в объеме нанолитра он оказывается слишком грубым. Для решения такой тонкой задачи воздух по-прежнему выступает как действующая физическая сила, однако уже не для распыления вещества, а для привода диафрагмы толкателя, который в свою очередь уже ответственен за точное дозирование биочернил в микро- и нанолитровых количествах.
Электроспиннинг (электроформование). Технология производства полимерных нанонитей (волокон субмикронной толщины) путем их вытяжения из капли расплава/раствора полимера электростатическим полем высокой напряженности.
TESA. Tissue engineering by self assembly. Технология создания графта/трансплантата путем свободной самоорганизации/самосборки клеток ткани в биореакторе без участия человека с последующей трансформацией (физической или химической) полученного материала перед имплантацией. Например, выращивание фиброзной пленки с помощью культуры фибробластов, а затем сворачивание ее в трубочку с покрытием эндотелиоцитами, чтобы получить ткане-инженерный трансплантат кровеносного сосуда.
Васкуляризация. Проблема создания графта/трансплантата с уже готовым капиллярным/сосудистым деревом, позволяющим ему оставаться функционально пригодным/валидным в физиологической среде реципиента.
Клеточная потенция.
Тотипотентность – способность клетки при делении воссоздавать все без исключения виды дифференцированных клеток организма. Из клеток, обладающих такой потенцией, можно получить как любые дифференцированные ткани, так и целиком эмбрион. Как правило, такая возможность у клеток есть лишь на стадии зиготы.
Плюрипотентность – способность клетки при делении образовывать клеточные линии основных зародышевых листков: эндодермы, мезодермы, эктодермы. Из плюрипотентных клеток также могут получаться большинство дифференцированных клеток взрослого организма, однако получение эмбриона целиком, как в случае с тотипотентными клетками, уже исключено. Эта клеточная потенция характерна для стволовых клеток зародышей/эмбрионов. Может быть искусственно приобретена дифференцированными клетками в результате биохимической активации или перепрограммирования генома, (индуцированная плюрипотентность).
Поли/мультипотентность – способность клетки при делении образовывать некоторые клеточные линии дифференцированных клеток взрослого организма, однако строго ограниченный спектр линий. Например, мезенхимальные (стромальные) стволовые клетки, которые при определенных условиях равновероятно могут дифференцироваться в хондроциты, остеобласты и адипоциты.
Олигопотентность – согласно логике по уменьшению потенции, способность клетки образовывать всего несколько (строго ограничено) дифференцированных линий. Например, внутрисосудистые стволовые клетки образовывают в равной степени эндотелиальные и гладкомышечные клетки.
iPSC – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Наряду с ADSC (MSC) могут являются основным источником (в аутологичном случае) клеточного материала для получения тканевых сфероидов и изготовления биочернил для биопринтинга.
Основные факторы, используемые при получении iPSC:
Oct3/4 ( также известен как POU5F1 – транскрипционный фактор №1 POU-домена пятого класса) – белок, ключевой фактор считывания генома (транскрипции), уровень экспрессии которого управляет судьбой эмбриональных клеток в развитии. Играет важную роль в процессе самообновления недифференцированных эмбриональных клеток
Sox2 – фактор, существенный для поддержания процесса самообновления у недифференцированных эмбриональных стволовых клеток. Обнаруживается у развивающихся клеток нейрональной трубки эмбриона, а также во время пролиферации/разрастания клеток-предшественников ЦНС
Nanog — это транскрипционный фактор, участвующий в самообновлении недифференцированных эмбриональных стволовых клеток. Потеря функции Nanog вызывает дифференцировку эмбриональных стволовых клеткок в другие типы клеток. Повышенная экспрессия Nanog в человеческих эмбриональных стволовых клетках обеспечивает их многократный пересев, при этом клетки остаются плюрипотентными. Последнее обстоятельство весьма важно для клеточной пропагации iPSC с целью масштабирования способов получения клеточного материала для целей биопринтинга.
STAT3 – белок, английская аббревиатура «передатчик сигналов и активатор транскрипции №3» Обладает высоким анти-апоптозным и пролиферативным эффектом.
APC/b-catenin – белок межклеточного взаимодействия, связанный с фактором опухолевой супрессии APC. Позволяет управлять клеточной пролиферацией.
c-Myc — белок-регулятор транскрипции до 15% всех генов. Регулирует структуру генома, изменяя ацилирование (реакции по изменению числа СО-окончаний аминокислот) связанных с ДНК белков.
Лентивирусы — разновидность ретровирусов, способных доставлять значительное количество генетического материала в клетку хозяина. Обладают уникальной среди ретровирусов способностью реплицироваться/размножаться в неделящихся клетках, что делает лентивирусы удобным вектором для доставки генетического материала в молекулярной биологии.